Separácia veľmi polárnych látok a štruktúrne podobných analytov na RP-HPLC

05. 04. 2016
V tradičnom systéme s reverznou fázou (RP) sa retencia zvyšuje s rastúcou hydrofobicitou analytu. Deje sa tak vďaka rastúcim interakciám medzi analytom a stacionárnou fázou. Naopak s rastúcou polaritou analytu sa stáva dominantnou interakcia analyt-mobilná fáza a retencia klesá. Separovať veľmi polárne látky pomocou kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou je náročné a problematické. Metódy vyžadujú veľa kompromisov (slabá retencia, nízke rozlíšenie) a obmedzení (výber mobilnej fáze a pufrov). Ponúka sa použitie HILIC separácie, najlepším a najjednoduchším riešením je porózny grafitizovaný uhlík – unikátna kolóna Thermo Scientific Hypercarb .

Obr. 1 Vplyv zloženia mobilnej fáze na retenciu uracilu u kolón HILIC a Hypercarb

Obr. 2 Ukážka separácie látok s rôznou polaritou na kolóne Hypercarb

Hypercarb poskytuje výnimočne silnú retenciu veľmi polárnych látok a naviac je schopný separovať štruktúrne podobné analyty. Toto správanie vysvetlujú hydrofóbne a elektrostatické retenčné mechanizmy.
Hypercarb je 100% porózny grafitizovaný uhlík (PGC). Na molekulárnej úrovni je povrch grafitu plochý a vysoko kryštalický na rozdiel od členitého povrchu silikagélu s viazanou fázou a zvyškovými silanolmi. V dôsledku toho je mechanizmus interakcií na PGC úplne odlišný. Celková retencia na kolóne Hypercarb je kombináciou dvoch mechanizmov: 1, hydrofóbna interakcia so stacionárnou fázou, keď s rastúcou hydrofobicitou analytov rastie retencia 2, nábojom indukovaná interakcia medzi polárnym analytom a polarizovateľným povrchom grafitu.

Obr. 3 Vplyv tvaru analytu na silu interakcie s povrchom grafitu: a) dobrý príklon rovinnej molekuly k povrchu grafitu, b) slabý príklon molekuly k povrchu grafitu

Obr. 4: Schematické znázornenie retencie polárnych látok, keď sa k povrchu grafitu priblíži: a) kladný náboj, b) záporný náboj, čo vedie k vytvoreniu nábojom indukovaného dipólu na povrchu grafitu

Polarizovateľnosť povrchu grafitu je kľúčom k pochopeniu mechanizmu retencie polárnych látok na jeho povrchu.
Sila interakcie závisí od veľkosti plochy molekuly, ktorá sa dostane do kontaktu s povrchom grafitu a od typu a umiestnenia funkčných skupín v mieste kontaktu s plochým grafitovým povrchom. Čím viac je molekula analytu rovinná, tým tesnejší bude jej príklon k povrchu grafitu a tým vznikne viac možných miest pre interakciu – teda maximálna retencia. Retencia sa znižuje u vysoko rozvetvených, 3-dimenzionálnych a pevných molekúl, u ktorých je v kontakte s grafitom len malá časť ich povrchu v porovnaní s rovinnými molekulami s rovnakou molekulovou hmotnosťou.

Vďaka týmto unikátnym vlastnostiam sú kolóny Hypercarb excelentné v separáciách vysoko polárnych látok, ako sú sacharidy a látky s niekoľkými hydroxylovými, karboxylovými alebo amino skupinami:

Častice Hypercarbu sú sférické a plne porózne bez chemicky viazanej fázy. Kolóny sú vďaka tomu úplne stabilné v celom rozsahu pH 0-14 a nie sú náchylné k agresívnym mobilným fázam. Robustná povaha tohto materiálu mu poskytuje výnimočnú životnosť. Vďaka svojej stabilite a tomu, že štruktúra PGC nijako neobmedzuje výber mobilných fáz, je vhodný pre LC/MS aplikácie. Pre zvýšenie rýchlosti analýz je možné rutinné používanie vyšších teplôt až do 200 °C bez straty účinnosti. Zníženie spätného tlaku umožňuje použitie dlhších kolón s menšou veľkosťou častíc a dosiahnutie ešte lepšieho rozlíšenia zložitých zmesí.
Hypercarb má ako stacionárná fáza v HPLC unikátne vlastnosti. Jeho selektivita sa líši od selektivity silikagélových alebo polymérnych kolón, keďže chemické vlastnosti jeho povrchu a retenčné mechanizmy sú úplne odlišné. K  nepolárnym látkam sa chová ako silikagél s viazaným alkylom a veľmi silnou retenciou, ničmenej retencia a selektivita pre polárne látky a štruktúrne podobné analyty je veľmi odlišná. Porózny grafitizovaný uhlík poskytuje excelentnú retenciu a separáciu veľmi polárnych látok a jeho povrch je stereo-selektívny so schopnosťou separovať geometrické izoméry, diastereoizoméry a ďalšie štruktúrne podobné analyty. Jeho kompatibilita so všetkými typmi mobilných fáz umožňuje separáciu látok so širokou škálou polarít v priebehu jednej analýzy a prináša obrovské separačné možnosti.

Viac o kolónach pre kvapalinovú chromtografiu nájdete tu .