IDENTIFIKÁCIA NEČISTÔT
Odhalenie a následná identifikácia minoritných nečistôt vedľa hlavných komponentov, či už
vo vstupných surovinách, procesných výrobných fázach či finálnych produktoch, sa stali
nočnou morou mnohých analytikov. Problém je zdanlivo banálny - nečistota je v priebežných
testoch skrytá pod hlavným píkom či plazivo narastie v stresových či stabilitných štúdiách,
kedy je produkt podrobený testovaniu v čase - a následný úder je oveľa bolestivejší,
pretože drvivá väčšina týchto nečistôt býva odhalená na HPLC s UV detekciou
(v 95% prípadov s mobilnou fázou nekompatibilnou s MS, tj. s neprchavými
anorganickými puframi alebo iónovo párovými činidlami) bez akéhokoľvek náznaku štruktúrnej
informácie.

obr. 1: ilustračný chromatogram výskytu nečistoty vo finálnom produkte
Bola už neznáma nečistota prítomná vo vstupnej surovine? Objavila sa ako degradačný produkt hlavnej látky? Zaniesla sa z výrobného procesu či migrovala z obalového materiálu (pozri problematika Extractables/Leachables )? Hmotnostný spektrometer s vysokým rozlíšením ( HRMS ) alebo spektrometer nukleárnej magnetickej rezonancie ( NMR ) síce stojí opodiaľ (v lepšom prípade), ale chýba prepojenie - ako dostať „vytúženú“ nečistotu do MS či NMR spektrometra? Ponúka sa:
1) previesť a optimalizovať metódu (mobilnú fázu, kolónu a ďalšie podmienky) z HPLC-UV na HPLC-MS zariadení a postupovať v identifikácii; táto možnosť je časovo náročná a nie je zrejmé a preukázateľné priradenie píku nečistoty v pôvodnej a novej metóde
2) frakcionovať nečistotu v semi-preparatívnom alebo v opakovanom analytickom móde pomocou zberača frakcií a následne izolovať z rozpúšťadla pre MS (resp. NMR) nevhodného (pôvodná mobilná fáza), čo je proces taktiež značne náročný (technický opis k stiahnutiu v aplikačnom liste a dokumentácii ku kolektoru)
3) vykonať on-line „výrez“ eluujúcej nečistoty (tzv. Heart-cutting), zachytiť ju na trap kolónke a nadávkovať do MS (s predradenou separáciou alebo bez) v druhom kanáli/dimenzii.

obr. 2: frakcionačný postup pri identifikácii nečistôt
S vývojom
duálnych systémov Vanquish
a plne „GMP compliance“ softvéru Chromeleon, ktorý je schopný integrovať separačnú,
izolačnú a aj časť HRMS (
Orbitrap
) sa táto možnosť javí ako ideálna. Navyše masívny nástup biofarmák na báze monoklonálnej
protilátky (mAB), ktorých charakterizačná procedúra označovaná ako
Multi Attribute Method (MAM)
sa bez MS nezaobíde, katapultovala Orbitrap na pomyselnú priečku štruktúrne analytického
nástroja číslo jedna. Nutné taktiež s rešpektom dodať, že chromatograficky separovať
niektoré blízke či
variantné analógy biofarmaceutických látok
bez zložitých - MS nekompatibilných - mobilných fáz (zatiaľ) nie je možné. Aj z týchto
dôvodov je rapídny rozvoj heart-cuttingu s orbitálnou pascou pod jedným softvérom
(taktiež popri ortogonálnej technike
ZipChip CE-MS
, kapilárnej elektroforézy na čipe vstavanom do iónového zdroja Orbitrapu) s vďakou
vítaný širokou obcou štruktúrnych analytikov na pokraji bezradnosti.

obr. 3: chromatogram doprovodných variantných analógov adalimumabu
Pri bližšom preskúmaní schémy duálneho systému Vanquish (a po prekonaní prirodzeného prvotného odporu k rozkľúčovaniu pozícií prítomných troch viaccestných ventilov), ktorý bol vyvinutý pre tieto účely, vyplynú nasledujúce úplne unikátne a oceniteľné vlastnosti:
- systém možno prevádzkovať ako 2D-HPLC so spomínaným heart-cutting
- systém je možné prevádzkovať bez akéhokoľvek HW prenastavenia ako dve nezávislé
a fluidne aj teplotne oddelené jednotky (HPLC-UV a HPLC-UV-MS) so spoločným
zásobníkom vzoriek (ale
dvoma oddelenými injektormi
)
- obe vyššie uvedené varianty sú ovládané jedným operátorom z jedného PC, pričom
separačná časť zostavy zaberie v laboratóriu plochu jedného HPLC.


obr. 4: schéma duálneho UHPLC systému Vanquish pre 2D-HPLC bez nutnosti manuálneho
prestavania na HPLC-UV a HPLC-UV-MS
Typická modelová situácia riešená s úsmevom, bez stresu a za potlesku zúčastnených môže vyzerať nasledovne:
Analytik prevedie sériu vzoriek od svojich kolegov - syntetikov a potvrdzuje navrhnuté štruktúry metódou A na systéme HPLC-UV-MS s Acclaim kolónou (pridáva navyše elementárne zloženie získané pri rozlíšení 140 000 FWHM a navrhuje štruktúry prítomných intermediátov). Popri tom s metódou B, ktorá má v mobilnej fáze obsiahnutý fosfátový pufor a trietylamín, skúma na C18 kolóne prítomnosť neznámej nečistoty, ktorú objavili jeho kolegovia z HPLC oddelenia a v stresových testoch narástla k úctyhodnému zastúpeniu 0,3%; vztiahnutá k hlavnej látke pri 280 nm. Pripravuje si metódu C, do ktorej vnáša retenčný čas skúmanej nečistoty, ktorá bude „vyrezaná“ z fosfátovej/trietylamínovej separácie, fokusovanej a prepláchnutej na on-line trap kolónke a vyčistená do fázy acetonitril/voda na Acclaim kolóne a podrobená MS experimentu. Prekvapivo potom zisťuje, že nejde o jednu nečistotu, ale dve izomerické formy a následne navrhuje ich elementárne zloženia a štruktúry (pomocou MS/MS, mzCloud a MassFrontier). Ide to s kolegami osláviť. Nie nerád, ale s rozpakmi. Je toho v poslednej dobe veľa. Po implementácii nového duálneho systému Vanquish s Orbitrapom zažíva úspechy spojené s oslavami denne.

Stiahnite si:
-
Flexible HPLC instrument setups for double usage as one heart-cut-2D-LC system or two 1D-LC systems
Nenechajte si ujsť ďalšie zaujímavosti
- Thermo Scientific SMART chromatografické striekačky
- LC-MS/MS kvantifikácia voľných metanefrínov v ľudskej plazme pre klinický výskum
- Kvantifikácia ôsmich antimykotík v ľudskej plazme pomocou kvapalinovej chromatografie - tandemovej hmotnostnej spektrometrie pre klinický výskum
- Biopsia dychu pomocou technológie GC-Orbitrap – neinvazívny prístup k odhaleniu choroby?
- Ultrazvuková pasterizácia omáčok, džúsov a nápojov