LC-MS okienko: Necielené metabolické profilovanie buniek ústneho karcinómu pomocou spojenia vysokotlakovej iónovej chromatografie a hmotnostného spektrometra o vysokom rozlíšení (HPIC-HRAM)

Každá analýza metabolitov, pokiaľ má byť z analytického hľadiska relevantná, si vyžaduje, nehľadiac na fyzikálno-chemické vlastnosti sledovaných metabolitov, spoľahlivú a zároveň robustnú analytickú techniku. V mnohých prípadoch, kedy je potreba identifikácia a stanovenie metabolitov, ktoré môžu byť malé, polárne až silne polárne molekuly, narážajú konvenčne používané chromatografické metódy na svoje principiálne limity. Napríklad chromatografia na reverznej fáze (RPLC) môže byť nedostatočne selektívna, hydrofilná interakčná chromatografia (HILIC) môže mať, aj napriek polárnej stacionárnej fáze, svoje limity. Ďalšou možnou alternatívou v analýze polárnych až silne polárnych látok je kapilárna elektroforéza (CE), napr. veľmi zaujímavou je ZipChip technológia - kapilárna elektroforéza na chipe implementovaná do iónového zdroja. Techniky plynovej chromatografie zas vyžadujú náročnú predúpravu vzorky formou derivatizácie, aby sledované analyty mohli byť plynovou chromatografiou separovateľné.

Vysokotlaková iónová chromatografia (Thermo Scientific™ Dionex™ ICS-4000 Caplillary High-Pressure™ Ion Chromatography HPIC™) s prietokmi v rozsahu 5-30 µl/min v spojení s hybridným hmostnostným spektrometrom (Thermo Scientific™ Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer) s vysokým rozlíšením (High-Resolution Accurate-Mass, HRAM) je v takýchto prípadoch ideálnym analytickým nástrojom s výhodou, že analyty sú už pri vstupe do iónového zdroja v ionizovanej forme. Eluent, v tomto prípade KOH, je vďaka systému automatickej supresie „prevedený“ na čistú vodu, čo umožňuje elimináciu nežiaducej interakcie korozívneho KOH v iónovom zdroji hmotnostného spektrometra (obr. 1).

Obr. 1: Schéma HPIC-HRAM zariadenia. Regenerácia supresora je zabezpečená externe použitím AXP pumpy. Po chromatografickej separácii, pred vstupom do iónového zdroja, za účelom podpory ionizácie, bola mobilná fáza obohatená o metanol s prídavkom 2 mM kyseliny octovej.

Obr. 1 – Schéma HPIC-HRAM zariadenia. Regenerácia supresora je zabezpečená externe použitím AXP pumpy. Po chromatografickej separácii, pred vstupom do iónového zdroja, za účelom podpory ionizácie, bola mobilná fáza obohatená o metanol s prídavkom 2 mM kyseliny octovej.

V prezentovanej porovnávacej štúdii bolo analyzovaných 42 štandardov polárnych metabolitov, z ktorých 21 vykazovalo problematické stanovenie. Následne bola realizovaná komparatívna analýza s využitím HPIC-HRAM, HILIC-HRAM a RP-UHPLC-HRAM. Výsledky na koncentračných úrovniach 600 ppb a 60 ppt pre IC-HRAM a 600 ppb pre HILIC-HRAM sú uvedené nižšie. RP-UHPLC-HRAM nie je z dôvodu neuspokojivého stanovenia uvedená (obr. 2).

Obr. 2: Výsledky stanovenia štandardov 21 polárnych metabolitov na koncentračných úrovniach 600 ppb a 60 ppt s použitím HPIC-HRAM inštrumentácie (vľavo a uprostred) a na koncentračnej úrovni 600 ppb za použitia HILIC-HRAM (vpravo)

Obr. 2 – Výsledky stanovenia štandardov 21 polárnych metabolitov na koncentračných úrovniach 600 ppb a 60 ppt s použitím HPIC-HRAM inštrumentácie (vľavo a uprostred) a na koncentračnej úrovni 600 ppb za použitia HILIC-HRAM (vpravo)

Na základe uvedeného bolo realizované komparatívne metabolické profilovanie bunkového lyzátu buniek ústneho karcinómu (Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC). Z 66 identifikovaných metabolitov bolo 65 stanovených za použitia HPIC-HRAM, 38 pomocou HILIC-HRAM a 29 pomocou RP-UHPLC-HRAM. Stanovenie 26 metabolitov bolo možné všetkými použitými technikami (obr. 3).

Obr. 3: Grafické zobrazenie prekryvu použitých analytických techník na stanovenie sledovaných  metabolitov

Obr. 3 – Grafické zobrazenie prekryvu použitých analytických techník na stanovenie sledovaných metabolitov

Separačná účinnosť ako aj selektivita HPIC bola jednoznačne preukázaná aj v prípade separácie 11 izomérov monofosfátov cukrov, pre m/z 259.0224 (obr. 4).

Obr. 4: Porovnanie separácie 11 izomérnych foriem monofosfátov cukrov (m/z = 259.0224) použitím HPIC (A), RP-UHPLC (B) a HILIC (C)

Obr. 4 – Porovnanie separácie 11 izomérnych foriem monofosfátov cukrov (m/z=259.0224) použitím HPIC (A), RP-UHPLC (B) a HILIC (C)

Viac informácií nájdete TU .