LC-MS okienko: Online SPE-UHPLC-HRMS analýza zmesi terapeutických proteínov

Oddelenie neprchavých solí, pufrov a ďalších zložiek od analytu, ktoré sú rovnako schopné interagovať so stacionárnou fázou chromatografickej kolóny a/alebo potláčať ionizáciu v iónovom zdroji hmotnostného spektrometra je z hľadiska analyticky správnych a presných výsledkov rozhodujúce. Príprava, najčastejšie extrakcia analytu na pevnej fáze (solid phase extraction, SPE) a potom zakoncentrovanie je dnes v laboratóriách analyzujúcich vzorky v zložitých matriciach technikami LC-MS resp. LC-MSMS rutinnou záležitosťou. Manuálna realizácia takéhoto predúpravného postupu je náročná na čas a rovnako môže byť zdrojom kontaminácie a veľkých odchýlok v rámci opakovateľnosti či reprodukovateľnosti analytických výsledkov.

Prezentovaná aplikácia zahŕňa automatizáciu tohto procesu ako on-line súčasť UHPLC -HRMS analýzy zmesi piatich terapeutických proteínov upravených pomocou 0.1% kyseliny mravčej (Formic acid, FA) na výslednú koncentráciu 60 µ g/ml (tab. 1).

Tab. 1: Zloženie analyzovanej zmesi terapeutických proteínov vrátane počiatočnej koncentrácie a zloženie stabilizačného tlmivého roztoku


Proteín  Počiatočná koncentrácia  Stabilizačný tlmivý roztok 
rituximab 10 mg/ml
polysorbát (0.7 mg/ml), citrát sodný (7.35 mg/ml), NaCl (9 mg/ml), NaOH/HCl 
alfa-laktalbumín
1 mg/ml   0.1% FA  
cytochróm c   1 mg/ml   0.1% FA  
myoglobín   1 mg/ml   0.1% FA  
ribonukleáza  A   1 mg/ml   0.1% FA  

Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC s prídavným viac-cestným ventilom a prídavnou kvartérnou nízkotlakovou pumpou (LPG) pumpou pre dávkovanie vzorky, ako technika pre predúpravu vzorky, ako aj separácia, predradená Thermo Scientific Q Exactive HF Hybrid Quadrupole Orbitrap hmotnostnému spektrometru (MS).

LPG pumpa pri použití izokraticky (0.1% TFA vo vode, 300 μl/min) umožňuje zachytenie analytu(ov) na „trap“-zachytávaciu kolónu (MSPac™ DS-10 Desalting Cartdridge) (2 minúty), následné použitie binárnej vysokotlakovej gradientovej pumpy (HPG) (0.1% FA v zmesi voda/acetonitril, 100 μl/min) v opačnom smere toku mobilnej fázy transport analytu(ov) cez separačnú kolónu MAbPac™ RP a až do oboch detektorov, t.j. VWD detektor (variable wavelenght detector) a následne do hmotnostného spektrometra (Obr. 1).

Obr. 1: Inštrumentálne zostavenie UHPLC s detailom ventilu

Obr. 1: Inštrumentálne zostavenie UHPLC s detailom ventilu (1), konfigurácia ventilu pre dávkovaciu a elučnú fázu (2) a profily mobilnej fázy pre dávkovaciu a elučnú pumpu (3) použité pri online SPE-UHPLC-HRMS analýze

Automatická príprava vzoriek vrátane samotnej analytickej metódy trvá menej ako 40 minút a zahŕňa 5-minútové koncidionovanie „trap“-zachytávacej kolóny. Použitie HPG pumpy umožňuje veľmi rýchlu separáciu a vďaka spojeniu s vysoko presným MS vo FullScan móde je možné stanovenie monoizotopickej hmotnosti všetkých komponentov s presnosťou pod 5 ppm. Total ion Current (TIC) spektrum spoločne s MS spektrami každého zo sledovaných analytov a detaily SPE-UHPLC-HRMS analýzy sú uvedené nižšie (obr. 2, tab. 2).

Obr. 2: Total Ion Current (TIC) spoločne s extrahovanými iónovými chromatogrammi pre 5 analyzovaných terapeutických proteínov

Obr. 2: Total Ion Current (TIC) spoločne s extrahovanými iónovými chromatogrammi pre 5 analyzovaných terapeutických proteínov

Tab. 2: Detailné výsledky SPE-UHPLC-HRMS analýzy pre jednotlivé stanovované terapeutické proteíny a ich glykované varianty


Proteín   Rt [min]   Teoretická MW [Da]   Experimentálna MW [Da]   Presnosť hmoty [ppm]   Priemerný počet skenov na spektrum   Rozlíšenie 
Ribonukleáza (hovädzia)   6.98   13673.260   13673.236   1.76   87   120 000  
Cytochróm c (hovädzí)   8.88   12222.200   12222.180   1.64
87   120 000  
Rituximab + 2 G0F glykány   11.06   147074.600   147074.630   -0.14   15   15 000  
Rituximab + G0F/G1F glykány   11.06
147236.740   147237.310   -3.81   15   15 000  
Rituximab + G0F/G2F alebo (G1F)2 glykány   11.06   147398.890   147398.170   4.89   15   15 000  
Rituximab + G1F/G2F glykány   11.06   147561.030   147560.970   0.41    15 15 000  
Myoglobín (konský)   11.65 16940.960   16940.956   0.24   87   120 000  
α-laktalbumín A (hovädzí)   11.65 14168.747   14168.728   1.36   87   120 000  

Pre viac informácií: Technical Note72161-EN 0217S