LC-MS okienko: Online SPE-UHPLC-HRMS analýza zmesi terapeutických proteínov
Oddelenie neprchavých solí, pufrov a ďalších zložiek od analytu, ktoré sú rovnako schopné interagovať so stacionárnou fázou chromatografickej kolóny a/alebo potláčať ionizáciu v iónovom zdroji hmotnostného spektrometra je z hľadiska analyticky správnych a presných výsledkov rozhodujúce. Príprava, najčastejšie extrakcia analytu na pevnej fáze (solid phase extraction, SPE) a potom zakoncentrovanie je dnes v laboratóriách analyzujúcich vzorky v zložitých matriciach technikami LC-MS resp. LC-MSMS rutinnou záležitosťou. Manuálna realizácia takéhoto predúpravného postupu je náročná na čas a rovnako môže byť zdrojom kontaminácie a veľkých odchýlok v rámci opakovateľnosti či reprodukovateľnosti analytických výsledkov.
Prezentovaná aplikácia zahŕňa automatizáciu tohto procesu ako on-line súčasť UHPLC -HRMS analýzy zmesi piatich terapeutických proteínov upravených pomocou 0.1% kyseliny mravčej (Formic acid, FA) na výslednú koncentráciu 60 µ g/ml (tab. 1).
Tab. 1:
Zloženie analyzovanej zmesi terapeutických proteínov vrátane počiatočnej koncentrácie a zloženie stabilizačného tlmivého roztoku
Proteín | Počiatočná koncentrácia | Stabilizačný tlmivý roztok |
rituximab |
10 mg/ml
|
polysorbát (0.7
mg/ml), citrát sodný (7.35
mg/ml), NaCl (9 mg/ml), NaOH/HCl
|
alfa-laktalbumín
|
1 mg/ml | 0.1% FA |
cytochróm c | 1 mg/ml | 0.1% FA |
myoglobín | 1 mg/ml | 0.1% FA |
ribonukleáza A | 1 mg/ml | 0.1% FA |
Thermo Scientific ™ Vanquish ™ Flex UHPLC s prídavným viac-cestným ventilom a prídavnou kvartérnou nízkotlakovou pumpou (LPG) pumpou pre dávkovanie vzorky, ako technika pre predúpravu vzorky, ako aj separácia, predradená Thermo Scientific ™ Q Exactive ™ HF Hybrid Quadrupole Orbitrap hmotnostnému spektrometru (MS).
LPG pumpa pri použití izokraticky (0.1% TFA vo vode, 300 μl/min) umožňuje zachytenie analytu(ov) na „trap“-zachytávaciu kolónu (MSPac™ DS-10 Desalting Cartdridge) (2 minúty), následné použitie binárnej vysokotlakovej gradientovej pumpy (HPG) (0.1% FA v zmesi voda/acetonitril, 100 μl/min) v opačnom smere toku mobilnej fázy transport analytu(ov) cez separačnú kolónu MAbPac™ RP a až do oboch detektorov, t.j. VWD detektor (variable wavelenght detector) a následne do hmotnostného spektrometra (Obr. 1).
Obr. 1: Inštrumentálne zostavenie UHPLC s detailom ventilu (1), konfigurácia ventilu pre dávkovaciu a elučnú fázu (2) a profily mobilnej fázy pre dávkovaciu a elučnú pumpu (3) použité pri online SPE-UHPLC-HRMS analýze
Obr. 2: Total Ion Current (TIC) spoločne s extrahovanými iónovými chromatogrammi pre 5 analyzovaných terapeutických proteínov
Tab. 2: Detailné výsledky SPE-UHPLC-HRMS analýzy pre jednotlivé stanovované terapeutické proteíny a ich glykované varianty
Proteín | Rt [min] | Teoretická MW [Da] | Experimentálna MW [Da] | Presnosť hmoty [ppm] | Priemerný počet skenov na spektrum |
Rozlíšenie
|
Ribonukleáza (hovädzia) | 6.98 | 13673.260 | 13673.236 | 1.76 | 87 | 120 000 |
Cytochróm c (hovädzí) | 8.88 | 12222.200 | 12222.180 |
1.64
|
87 | 120 000 |
Rituximab + 2 G0F glykány | 11.06 | 147074.600 | 147074.630 | -0.14 | 15 | 15 000 |
Rituximab + G0F/G1F glykány |
11.06
|
147236.740 | 147237.310 | -3.81 | 15 | 15 000 |
Rituximab + G0F/G2F alebo (G1F)2 glykány | 11.06 | 147398.890 | 147398.170 | 4.89 | 15 | 15 000 |
Rituximab + G1F/G2F glykány | 11.06 | 147561.030 | 147560.970 | 0.41 | 15 | 15 000 |
Myoglobín (konský) | 11.65 | 16940.960 | 16940.956 | 0.24 | 87 | 120 000 |
α-laktalbumín A (hovädzí) | 11.65 | 14168.747 | 14168.728 | 1.36 | 87 | 120 000 |
Pre viac informácií: Technical Note72161-EN 0217S
Nenechajte si ujsť ďalšie zaujímavosti
- Thermo Scientific SMART chromatografické striekačky
- LC-MS/MS kvantifikácia voľných metanefrínov v ľudskej plazme pre klinický výskum
- Kvantifikácia ôsmich antimykotík v ľudskej plazme pomocou kvapalinovej chromatografie - tandemovej hmotnostnej spektrometrie pre klinický výskum
- Biopsia dychu pomocou technológie GC-Orbitrap – neinvazívny prístup k odhaleniu choroby?
- Ultrazvuková pasterizácia omáčok, džúsov a nápojov