V minulom roku uzrela svetlo sveta nová revolučná konfokálna platforma STELLARIS. Po niekoľkých rokoch nahradila úspešnú platformu Leica TCS SP8, ktorá vynikla predovšetkým vďaka jednoduchosti použitia a unikátnym vlastnostiam. Leica STELLARIS predchádzajúcu platformu predbehne hneď v niekoľkých faktoroch, ktoré si postupne predstavíme v niekoľkodielovom seriáli. Prvý diel je venovaný spôsobu detekcie a novým detektorom.

Spôsob detekcie

U platformy STELLARIS je zachovaný úplne unikátny spôsob detekcie, na miesto dichroických zrkadiel (čím viac dichroických zrkadiel, tým nižšia priepustnosť celého systému) pre naviazanie niekoľkých laserov je použitý programovateľný kryštál s názvom AOBS (Acousto Optical Beamsplitter). Tento kryštál umožňuje naviazať až 8 vlnových dĺžok súčasne, bez nutnosti prídavných filtrov. Ďalšou výraznou výhodou je zreteľne lepší spektrálny charakter pre emisnú časť (o tejto výhode v ďalšom diele).

Leica je v spôsobe rozloženia detektorov a generovania signálu unikátna. Prečo takéto rozloženie detektorov? Odpoveď je jednoduchá, signál sa rozkladá cez kryštál, ktorý generuje celé spektrum, následne mieri do prvého detektora, ktorým možno vybrať akúkoľvek oblasť pre detekciu. Žiadny signál nie je stratený, vďaka vysoko reflexným spektrálnym zrkadlám je odrazený na ďalší detektor a opäť si možno vybrať spektrum, ktoré je potrebné. Situácia sa opakuje až do piateho detektora, ako je zobrazené na obr. 1.

Obr. 1 - Generovanie signálu pomocou hranola a spektrálna detekcia

Jednotlivé detektory možno hardvérovo nastaviť presne pre dané spektrum a získať tak maximum signálu. Detektor vie využiť všetky informácie (emisné spektrum daného fluorofóru) a dynamický rozsah, niektoré i lifetime a potom optimálne nastaviť - viď obr. 2. Pre takéto rozloženie sa nestratí žiadny fotón!

Obr. 2 – Ukážka použitia jednotlivých detektorov a hardvérové oddelenie emisných spektier

Celková schéma zapojenia systému STELLARIS je zobrazená na obr. 3. Je možné pripojiť veľké množstvo laserových zdrojov, ale o nich budeme písať v ďalšom diele seriálu. Sú uvedené dva kľúčové prvky AOBS a spektrálna detekcia. To všetko nám teraz postačí, aby sme si povedali o nových detektoroch systému STELLARIS.

Obr. 3 – Skenovacia jednotka systému STELLARIS 8

Technológia nových detektorov

V novom systéme sa objavili hneď tri nové typy detektorov rodiny Power HyD . Detektor Power HyD S má najvyšší dynamický rozsah a veľmi široké pokrytie spektra zo všetkých detektorov. Tento detektor je vhodný pre takmer všetky konfokálne aplikácie. Power HyD R detektor je špeciálne upravený pre snímanie spektra v NIR oblasti až do 850 nm. Je vhodný predovšetkým pre dlhodobé experimenty. Posledný z radu je Power HyD X detektor, ktorý je optimálny pre lifetime aplikácie a predovšetkým pre FLIM, FCS.

Power HyD S detektor je odlišný. Tvorí základ STELLARIS systému. Základom je silicon based multi-pixel photon counter (MPCC), ktorý používa multi-cell architektúru a princíp lavínovej fotodiódy pre vyčítanie signálu pre odstránenie šumu a zlepšenie efektivity zbierania jednotlivých fotónov. Tento detektor je možné prepnúť z analógového módu do photon counting módu. Vďaka tejto vlastnosti je použitie tohto detektora možné pre veľmi široké spektrum konfokálnych aplikácií. Pre photon counting mód sú odlíšené jednotlivé fotóny s vysokou presnosťou a kvantifikovateľnými dátami. U druhého analógového módu je signál integrovaný cez čas, čo má za následok vysoký dynamický rozsah. Princíp je zobrazený na obr. 4. Oba ďalšie typy detektorov sú založené na princípe lavínovej fotodiódy, kde sa signál urýchľuje vysokým napätím a cez ultrasenzitívnu GAsP vrstvu sa generujú jednotlivé fotóny bez dodatočného šumu. Jedná sa o jeden z najrýchlejších detektorov s možnosťou použitia pre FLIM, FCS metódy.

Obr. 4 Nový rad detektorov pre STELLARIS, vrátane princípu generovania signálu: Power HyD S, HyD X a HyD R

Každý fotón sa ráta!

Dynamický rozsah detektora určuje, koľko rôznych stupňov intenzity možno sledovať vo Vašom obrázku. Vysoký dynamický rozsah je nevyhnutný pre zobrazenie heterogénnych intenzít signálu a veľkých fluktuácií cieľových molekúl bežných v biologických aplikáciách. Power HyD S technológia poskytuje viac ako dvojnásobok dynamického rozsahu než klasické photon counting metódy. Táto schopnosť zlepšuje kontrast obrazu, najmä pri vysokých intenzitách signálu, kde je oveľa väčšia pravdepodobnosť prekrývajúcich sa fotónov. Tradičné metódy a detektory PMT, či GAsP PMT pre počítanie fotónov nemožno presne zaznamenať dva rýchle prichádzajúce fotóny za sebou, viď obr. 5. Power counting mód vďaka veľmi presnej analýze šírky pulzov a počítania energie túto vlastnosť tradičných detektorov umožnia.

Obr. 5 - Rozdiel konvenčných detektorov a power counting detektorov

Ukážka a porovnanie power counting módu je zobrazené na obr. 6. Vždy konvenčné photon counting a power counting. Preparáty sú fixované HeLa bunky značené WGA 405 (HyD S), ɑTubulin-AF555 (HyD X) a ɑTom20-AF750 (HyD R).

Obr. 6 – Ukážka porovnania pre fixované HeLa bunky

Vylepšený výkon v celom spektre

Nech sú Vaše preferované fluorescenčné značky akékoľvek, citlivosť detektorov môže byť kritická. Jedná sa predovšetkým o photobleaching, photodamage a získanie maximálneho signálu predovšetkým pre live-cell aplikácie. STELLARIS s rodinou Power HyD je schopný ponúknuť vylepšené detekčné schopnosti v celom spektre. Jadrá detektorov Power HyD S dosahujú (PDE) až 56%, čo je viac ako dvojnásobok oproti konvenčným multi-alkáli detektorom tzn. fotonásobiča (PMT). Táto ultracitlivá detekcia je pre takmer celý rozsah bežne používaných fluorofórov, ako napríklad CFP alebo GFP. Detektory Power HyD S taktiež poskytujú dobrú citlivosť do červenej, a dokonca aj do blízkej infračervenej (NIR) spektrálnej oblasti. Systém STELLARIS 8 potom ponúka ľubovoľnú kombináciu detektorov Power HyD S, HyD R a HyD X a umožňuje najširšiu škálu aplikácií, viď obr. 7.

Obr. 7 – Spektrum pre jednotlivé detektory rodiny Power HyD

Aký detektor použiť?

Neviete si rady, aký detektor použiť? Voľte Power HyD S či si vyberte metódu, ktorú potrebujete. Ak stále neviete, kontaktuje nás, radi Vám poradíme. Porovnávacia tabuľka je na obr. 8.

Obr. 8 – Metódy a použitia jednotlivých detektorov pre systémy STELLARIS

Čo bude v ďalšom diele?

V ďalšom diele sa zameriame na možnosti použitia jednotlivých laserov. Tiež si povieme niečo viac o AOBS a pozrieme sa na technológiu TauSENSE.

Na niečo sme zabudli? Niečo nie je správne opísané či máte akúkoľvek otázku, napíšte nám na kopecky@pragolab.cz