THUNDER systémy Leica Microsystems

Blýska sa na lepšie časy?

Leica Microsystems v minulom roku predstavila technológiu, ktorá zásadne zmenila možnosti v zobrazovaní objemných vzoriek klasickým fluorescenčným mikroskopom. Jedná sa o sériu zobrazovacích zariadení THUNDER. Skladá sa z najpokročilejších modelov mikroskopov podporených algoritmom pre digitálne vyčistenie (clearing) vzorky. A práve digitálny clearing tvorí jadro tejto novej technológie. Pre dokonalý výsledok sú nové systémy THUNDER podporené možnosťou adaptívnej dekonvolúcie, prevzaté zo super-rezolučného modulu Lightning pre konfokálne mikroskopy Leica TCS SP8. Digitálny clearing totiž vôbec neupravuje PSF zaostrených štruktúr. Tie potom môžete vylepšovať pomocou vyššie uvedených dekonvolučných algoritmov.

Obr. 2: Tá istá vzorka nasnímaná na THUNDER systéme

Za vzpriamené mikroskopy zastupujú sériu THUNDER modely Leica DM4 a DM6, za invertované mikroskopy platforma Leica DMi8 a za stereomikroskopy Leica M205 FA a FCA. Vďaka tomu je možné využiť sily digitálneho clearingu pre veľmi široké spektrum vzoriek: od subbunečných štruktúr až po celé organizmy.

  Obr. 3: Séria THUNDER je založená na vlajkových lodiach jednotlivých radov mikroskopov Leica Microsystems

Ako to funguje?

TU nájdete odkaz na veľmi podrobný technologický opis celej technológie THUNDER. Pre tento článok sme zvolili veľmi stručný súhrn. K podrobnému popisu technologických a matematických detailov najlepšie poslúži priložený technologický list.   Podľa typu použitého dekonvolučného parametra je možné na vzorku aplikovať tri základné postupy.

Instant Computational Clearing (ICC)

Tu sa jedná o čistý clearing bez použitia dekonvolučného algoritmu. Súhrnne možno povedať, že THUNDER dokáže podľa typu PSF rozoznať, či sa jedná o signál z danej optickej roviny, či ide len o rozostrený signál zo štruktúr nad či pod rovinou ostrosti. Takýto signál je potom oddelený a nie je do finálneho obrazu zahrnutý. To, čo sa na prvý pohľad môže zdať jednoduché, je dosiahnuté vďaka robustnému algoritmu, spätnej väzbe z optického systému do softvéru a tiež vďaka veľmi silným výpočtovým staniciam, ktoré sa o chod Leica THUNDER systémov starajú. Dôležitou prednosťou tejto metódy je uchovanie pôvodnej PSF zo štruktúr v danej rovine.

Small Volume Computational Clearing (SVCC) a Large Volume Computational Clearing (LVCC)

Po vyčistení obrazu pomocou CC sa navyše aplikuje adaptívna dekonvolúcia dedikovaná pre spracovanie tenkých, alebo naopak, vrstevnatých vzoriek. Tá deteguje lokálny pomer signálu a šumu pre správne nastavenie parametrov dekonvolúcie, a to separátne pre každý Voxel zvlášť. (Voxel = pixel v trojrozmernej mriežke dát). Tento proces prebieha automaticky a nevyžaduje žiadne zadávanie hodnôt užívateľom.

Iba softvér?

Existujúce techniky vylepšenia widefieldového snímania na hardvérovom základe so sebou prinášajú sériu nevýhod, ako sú strata rýchlosti, citlivosti a zvýšený výskyt artefaktov. Technológie, ktoré by tieto nevýhody nemali a zároveň by menili spôsob samotného získavania surového signálu, sa však zatiaľ pre bežných užívateľov na obzore neobjavujú. Digitálny clearing pracujúci s konvenčným fluorescenčným obrazom so sebou prináša mnoho nepopierateľných výhod. Najvýraznejším benefitom je vysoká rýchlosť a citlivosť. Keďže nie je potrebné pre získanie snímok pridávať do optickej trasy ďalšie prvky, alebo zhotovovať pre výsledný efekt viacej snímok, nestrácajú systémy THUNDER oproti klasickým mikroskopom na rýchlosti a sú veľmi odolné proti prípadným artefaktom vznikajúcim pohybom a zmenou intenzity pri dlhších expozíciách. Sú tak výbornou voľbou aj pre live-cell imaging, a to aj na úrovni jednotlivých buniek, aj na úrovni 3D bunkových kultúr, ako sú bunky v 3D nosičoch, sféroidy a organoidy. U 3D bunkových kultúr sa výhody digitálneho clearingu prejavia v plnej miere.

Obr. 4: Migrujúce C2C12 bunky nasnímané invertovaným THUNDER Imagerom pre 3D Live Cell. Fialovo sú značené jadrové štruktúry (lamin B), modro DNA (Hoechst) a žlto poškodenie DNA (γH2AX). Snímka je zložená z jednotlivých rovín. Výsledkom je snímka s hĺbkou ostrosti 17,47 µm.

Ďalšou prednosťou týchto systémov je zachovanie citlivosti snímania. Aj keď je celkový signál o niečo slabší v dôsledku separácie signálu pozadia, signál vystupujúci z jednotlivých štruktúr si zachováva svoj pôvodný jas.
Benefitom je jednoduchosť používania týchto systémov. Od konvenčného snímania sa líšia iba vo výbere preferovanej metódy a zadaní kultivačného média, presnejšie jeho indexu lomu. To je jediná hodnota z celej optickej trasy, ktorú tieto mikroskopické systémy nepoznajú.
Leica THUNDER ponúka pre pokročilých používateľov zvyknutých na plnú kontrolu systému mód, kde je možné mnoho parametrov dekonvolúcie a i samotného clearingu nastaviť manuálne. Navyše nie je potrebné po celú dobu spracovania opúšťať príjemné užívateľské rozhranie ovládacieho programu a dáta zložito spracovávať cez externý softvér, ktorý by výsledný obraz spracoval.

Obr. 5: Ovládací panel THUNDER. Po výbere požadovanej metódy stačí len zadať refraktívny index vzorky a môžete snímať. Rozšírené nastavenia potom roztvoria ponuku pre manuálne nastavenie, kde možno ovplyvniť značné množstvo parametrov a dig. clearingu

Je dobré spomenúť, že všetky zábery nasnímané na systéme THUNDER sú previazané s potrebnými metadátami nesúcimi informácie potrebné na vykonanie optického clearingu. Optický clearing vzorky je teda možné vykonať aj po nasnímaní. Avšak rýchlosť celého procesu je taká, že pri aktivácii prebieha v reálnom čase a clearing je aplikovateľný aj na živý náhľad vzorky! Táto vlastnosť predurčuje využitie digitálneho clearingu predovšetkým v simultánnom móde už pri snímaní Vašich dát.
THUNDER systémy však vždy uchovávajú taktiež surové widefield dáta a Vy ich tak budete mať po ruke pre potreby porovnania, kvantifikácie alebo aplikácie odlišných parametrov pre optický clearing.

Ušetríte čas

Obrazová kvalita snímok z THUNDER systémov vám umožní preniesť mnohé aplikácie z večne vyťažených konfokálnych systémov na konvenčné fluorescenčné mikroskopy.
Pri vzorkách, ktoré konfokálnu mikroskopiu aj napriek tomu vyžadujú, potom THUNDER systémy v súčinnosti s modulom LAS X NAVIGATOR tvoria ojedinelý odrazový mostík pre prípravu snímania na konfokálnych mikroskopoch. Vytvoríte ľahko prehľadový snímok vysokej kvality bez prirodzeného zahmlenia a ľahko definujete oblasti záujmu. Následne stačí preniesť vzorku, nahrať súbor do konfokálneho mikroskopu a spustiť finálne skenovanie. Výrazne tak skrátite a zefektívnite čas strávený na konfokálnych mikroskopoch v tesných a spoplatnených časových oknách, ako tomu u týchto systémov často býva.

Obr. 6: V kombinácii s LAS X navigator môžete využiť THUNDER systémy pre vytváranie prehľadových snímkov a určenie súradníc pre konfokálne systémy

Na vlastné oči

Čo povedať na záver? Vplyv výpočtovej techniky presakuje každým odborom ľudskej činnosti. U mikroskopického snímania je tak už dlho a systémy Leica THUNDER prinášajú ďalší výrazný pokrok v možnostiach a užívateľskej prívetivosti widefieldového snímania. Po prekonaní prirodzeného ostychu pred novými technológiami na Vás čakajú nové obzory možností mikroskopie. Ak budete mať možnosť vyskúšať THUNDER systémy priamo na Vašich vzorkách, neváhajte ani sekundu a presvedčte sa osobne, alebo sa nechajte inšpirovať v našej galérii.

Video od produktovej manažérky

Nadchádzajúce akcie s Leica THUNDER systémami: