Ultraviolet photodissociation (UVPD) - univerzálna a inovatívna fragmentácia na vyššej úrovni

Z hľadiska moderných aplikácií v hmotnostnej spektrometrii je samotná informácia o molekulovej hmotnosti už mnohokrát nedostatočná. Nezastupiteľnú úlohu tak zohrávajú štruktúrne informácie získané analýzou fragmentačných spektier materských iónov pri vysokom rozlíšení. Potreba jednoznačnej identifikácie látok úzko súvisí s rozvojom rôznych fragmentačných techník pre MS inštrumentáciu.

Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ ponúka okrem iného nielen konvenčné fragmentačné techniky na rôznych stupňoch separácie v MS, ako napr. Collision-induced dissociation (CID), Higher-energy C-trap dissociation (HCD), Electron transfer dissociation (ETD) a Electron-Transfer/Higher-Energy Collision Dissociation (EThcD), ale predovšetkým potom úplne inovatívnu Ultraviolet photodissociation (UVPD) fragmentačnú techniku.

Disociácia za účasti fotónov využíva absorpciu týchto častíc cieľovou molekulovou, čo vedie k zvýšeniu jej vnútornej energie a následnej disociácii. Na rozdiel od zrážkou indukovaných disociácií (CID, HCD), či ETD, EThcD, absorpcia fotónov úzko súvisí so štruktúrou cieľovej molekuly resp. molekulového iónu. Preto je voľba správnej energie žiarenia emitovaného laserom veľmi dôležitá. Cieľová molekula je zachytená vo vysokotlakovom regióne lineárnej iónovej pasce, kde dochádza k fragmentácii. Následné fragmenty sú podrobené analýze o vysokom rozlíšení v orbitálnej pasci (obr. 1).

Obr. 1: Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ hmotnostný spektrometer s dodatočným „ultraviolet photodissociation“ (UVPD) zdrojom pre fragmentáciu molekúl v zadnej časti lineárnej iónovej pasce

Obr. 1 – Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ hmotnostný spektrometer s dodatočným „ultraviolet photodissociation“ (UVPD) zdrojom pre fragmentáciu molekúl v zadnej časti lineárnej iónovej pasce

Použitím vyššie uvedeného prístupu sa otvárajú úplne nové možnosti v mnohých aplikačných oblastiach.

Vysokorozlišovacia analýza MS2 spektra troch segmentov Rituximabu (liečivo používané pri niektorých autoimunitných ochoreniach ako aj nádorových ochoreniach) za použitia UVPD spoločne s ETD a EThcD viedla k nárastu identifikácie aminokyselinového zloženia Fc/2 o 20%, LC o 20.7% a Fd o 19.8% v porovnaní s pokrytím za použitia len ETD a EThcD fragmentačných spektier (obr. 2).

Obr. 2: Chromatografická separácia troch segmentov (Fc/2, LC, Fd) monoklonálnej protilátky Rituximab (A) a následná identifikácia ich aminokyselinového zloženia pomocou analýzy UVPD, ETD a EThcD fragmentačných spektier, porovnanie výťažnosti v závislosti od použitej fragmentačnej techniky

Obr. 2 – Chromatografická separácia troch segmentov (Fc/2, LC, Fd) monoklonálnej protilátky Rituximab (A) a následná identifikácia ich aminokyselinového zloženia pomocou analýzy UVPD, ETD a EThcD fragmentačných spektier, porovnanie výťažnosti v závislosti od použitej fragmentačnej techniky

Zásadne nové možnosti prináša UVPD v oblasti štruktúrnej identifikácie lipidov. Lokalizácia dvojitých väzieb v molekule triacylglycerolu (TAG) bola donedávna za použitia CID alebo HCD takmer nemožná. HRAM-UVPD-MSn analýza poskytuje podobné fragmentačné vlastnosti ako CID/HCD, avšak navyše vznikajú ióny indikujúce polohu dvojitých väzieb, viď obr. 3.

Obr. 3: HRAMS-UVPD-MSn fragmentačné spektrum triacylglycerolu (TAG) s vyznačenými diagnostickými iónmi pre polohu dvojitých väzieb

Obr. 3 – HRAMS-UVPD-MSn fragmentačné spektrum triacylglycerolu (TAG) s vyznačenými diagnostickými iónmi pre polohu dvojitých väzieb

Okrem horeuvedených proteomických a lipidomických aplikácií ponúka UVPD fragmentácia bohaté využitie aj v analýze malých molekúl, ako napr. uvádza štúdia na konjugátoch fenylpropanoidov, molekúl zohrávajúcich zásadnú úlohu v štúdiu rastlinných signálnych dráh. HRAM-UVPD-MSn analýza kyseliny chlorogenovej ukázala vznik jedinečných fragmentov, ktoré neboli pri použití inej fragmentačnej techniky pozorované a môžu mať významnú informačnú hodnotu pri štruktúrnom stanovovaní ďalších konjugátov tejto skupiny látok (obr. 4).

Obr. 4: Porovnanie HRAM-UVPD/HCD-MSn spektier kyseliny chlorogenovej. Viditeľné sú špecifické fragmenty poskytujúce iba UVPD fragmentácie

Obr. 4 – Porovnanie HRAM-UVPD/HCD-MSn spektier kyseliny chlorogenovej. Viditeľné sú špecifické fragmenty poskytujúce iba UVPD fragmentácie

Pre viac informácií: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/IQLAAEGAAPFADBMBHQ

Zdroje:

Utilizing UVPD Fragmentation for Plant Molecules: Phenylpropanoids
The “ETD-like” Fragmentation of Small Molecules
Designed to Fragment the Most Challenging Compounds