Pokročilé technológie v ICP-MS pre prekonávanie interferencií pri mapovaní distribúcie prvkov v biologických vzorkách pomocou LA-ICP-MS – iCAP TQ

Úvod

V oblasti "life science" štúdií stále vzrastá počet publikovaných prác, ktoré sú sústredené na techniky umožňujúce zobrazovanie priestorovej distribúcie prvkov. Pre stopové a ultrastopové mapovanie prvkov je vhodnou technikou laserová ablácia v spojení s hmotnostnou spektrometriou indukčne viazanej plazmy (LA-ICP-MS), ktorá sa vyznačuje vysokou citlivosťou, širokým lineárnym rozsahom a možnosťou stanovenia presnej kvantity. Všeobecne sa metóda ICP-MS môže stretnúť s radom izobarických a polyatomických interferencií, ktoré môžu viesť k falošne pozitívnym výsledkom. U metódy LA-ICP-MS, kedy je doba trvania signálu veľmi krátka, sa interferencie ešte ťažšie predikujú.

ICP-MS s trojitým kvadrupólom (iCAP TQ ICP-MS, Thermo Scientific) umožňuje použitie špecificky selektívnej reakcie, ktorá spôsobí posun hmoty analytu alebo interferentu ("mass shift"), a tak uľahčuje analýzu zložitejšie merateľných prvkov ako je železo, selén, fosfor a ďalšie. Obrovský prínos má toto riešenie interferencií práve v zobrazovaní distribúcie prvkov v biologických vzorkách, ktoré sú často v podobe veľmi tenkých rezov a vyžadujú stanovenie s dobrým priestorovým rozlíšením. Množstvo vzorky, ktoré je po interakcii s laserovým pulzom unášané do ICP je tak veľmi malé.

Obr. 1: LA-ICP-MS: Thermo Scientific iCAP TQ ICP-MS+ laserový ablačný systém CETAC Technologies LSX-213 G2+

Inštrumentácia

Pre analýzu CETAC Technologies LSX-213 G2+ bol pripojený k iCAP TQ ICP-MS. Pre zaistenie detekcie aj veľmi malých koncentrácií prvkov pri malom množstve ablatovanej vzorky bola u ICP-MS použitá konfigurácia pre vysokú senzitivitu. Parametre sú uvedené v Tab. 1.

Obr. 2: Parametre prístrojového vybavenia LA-ICP-MS

Pred samotnou analýzou boli pomocou softvéru Qtegra Intelligent Scientific Data Solution (ISDS) automaticky nastavené parametre pre plazmu aj rozhranie a plne prispôsobené pre meranie s laserovou abláciou. Boli použité tri módy merania:

SQ-O₂ – jednoduchý kvadrupól s kolízne reakčnou celou (CRC – collision/reaction cell) natlakovanou kyslíkom ako reakčným plynom

SQ-KED – jednoduchý kvadrupól s CRC natlakovanou héliom ako kolíznym plynom v móde diskriminácie kinetickou energiou (KED – kinetic energy discrimination)

TQ-O₂ – trojitý kvadrupól s CRC natlakovanou kyslíkom ako reakčným plynom, prvý kvadrupól (Q1) nastavený na hmotu analytu (M⁺) a tretí kvadrupól (Q3) nastavený na hmotu produktu reakcie analytu s kyslíkom (MO⁺)

Príprava vzorky

Stonky a listové stopky tabaku boli zmrazené v médiu hydroxyetyl celulóza (médium s nízkym obsahom Ca) a rezané pomocou kryostatu na rezy s hrúbkou 30 mikrometrov. Rezy boli následne prenesené na kremenné sklíčka (tiež s nižším obsahom Ca než bežné borosilikátové sklá).

Obličky krysy boli rezané v médiu Technovit^® na rezy s hrúbkou 5 mikrometrov a prenesené na bežné sklíčka.

Pečeň krysy bola zmrazená a pomocou kryostatu boli vyhotovené rezy s hrúbkou 5 mikrometrov a prenesené tiež na bežné sklíčka.

Výsledky – porovnanie SQ-O₂ a TQ-O₂ pri mapovaní distribúcie P, S a Ca v priečnom reze stopiek tabaku

Pre rastlinné vzorky ako je tabak ( Nicotiana tabacum ) sú pre stanovenie významné hlavne nutričné prvky, ako je napr. Ca. Vápnik hrá dôležitú úlohu v obranných mechanizmoch rastliny, pri jej hojení poškodených pletív a má významnú funkciu pri prenose signálov u eukaryotických buniek. Zmeny v distribúcii počas rôznych štádií rastu rastliny, alebo tiež rozdiely v distribúcii Ca medzi prírodnými a geneticky upravenými rastlinami, môžu byť dôležité informácie objasňujúce spomínané mechanizmy. Aj keď LA-ICP-MS je veľmi užitočný nástroj pre mapovanie prvkov v biologických materiáloch, analýza vápnika pomocou jednoduchého kvadrupólu (SQ-ICP-MS) je sťažená interferenciami s nosným aj kolíznym plynom (napr. ⁴⁰Ar⁺ a ⁴⁰Ca⁺, ⁴⁰Ar⁴He⁺ a ⁴⁴Ca ⁺) a tiež interferenciami s matričnými prvkami (napr. ³⁹K¹H⁺ a ⁴⁰Ca⁺).

Fosfor a síra sú často používanými prvkami pre vizualizáciu mnohých biologických vzoriek, keďže sú prítomné vo všetkých bunkách a poskytujú jasnú štruktúrnu informáciu. Aj tu sú pri použití SQ-ICP-MS problémové interferencie ako napr. ¹⁶O¹⁶O⁺ a ³²S⁺.

Pre porovnanie výsledkov jednoduchého a trojitého kvadrupólu boli analyzované vzorky listovej stopky tabaku (Obr. 1) pomocou módu SQ-O₂ (pravá polovica listovej stopky - Obr. 2) a módu TQ-O₂ (ľavá polovica listovej stopky - Obr. 3). K eliminácii interferencií bol pri oboch módov použitý kyslík ako reakčný plyn, čo vedie k posunu hmoty (mass shift) u všetkých troch analytov: ³¹P→³P¹⁶O, ³²S→³²S¹⁶O, ⁴⁴Ca→⁴⁴Ca¹⁶O.

Obr. 3: Priečny rez stopkou listu tabaku

Obr. 4: Mapy distribúcie prvkov v priečnom reze listovej stopky tabaku získané pomocou LA-ICP-MS v móde SQ-O₂ – vľavo ³¹P¹⁶O, uprostred ³²S¹⁶O a vpravo ⁴⁴Ca¹⁶O

Obr. 5: Mapy distribúcie prvkov v priečnom reze listovej stopky tabaku získané pomocou LA-ICP-MS v móde TQ-O₂ – vľavo ³¹P¹⁶O, uprostred ³²S¹⁶O a vpravo ⁴⁴Ca¹⁶O

Ako je zrejmé z Obr. 4 a Obr. 5, reakcia vedúca k posunu hmoty úspešne odstránila väčšinu interferencií pre P a S v móde SQ aj TQ. Štruktúra priečneho rezu stopky je jasne oddelená od pozadia. Možno tiež pozorovať vysoký obsah P v použitom médiu pri rezaní, čo je viditeľné v oboch módoch.

Pre Ca posun nie je posun hmoty reakciou s kyslíkom dostačujúci pre efektívne odstránenie interferencií, čo sa prejavilo neostrým obrazom listovej stopky pri použití SQ módu, kde sú viditeľné len niektoré výraznejšie body. Tieto body zodpovedajú idioblastom, teda špecializovaným bunkám, ktoré akumulujú šťaveľan vápenatý ako obranu proti bylinožravcom. Naproti tomu za použitia módu TQ možno vápnik úspešne mapovať na celej ploche vzorky, vrátane trichómov a jemných štruktúr.

Výsledky - porovnanie SQ-O₂ a TQ-O₂ pri mapovaní distribúcie Fe a Se v rezoch obličky a pečene krysy

Pre tenké rezy živočíšnych tkanív je stanovenie priestorovej distribúcie i viacerých prvkov naraz veľmi žiadané. LA-ICP-MS je teda výborným kompromisom medzi počtom analytov, ktoré je možno merať naraz, a citlivosťou a priestorovým rozlíšením. Podobne ako u rastlinných vzoriek je mnoho prvkov zaťažené interferenciami ako napr. železo (⁴⁰Ar¹⁶O⁺ a ⁵⁶Fe⁺) alebo selén (⁴⁰Ar⁴⁰Ar⁺ a ⁸⁰Se⁺).

Pre porovnanie oboch módov, teda jednoduchého a trojitého kvadrupólu, boli pripravené dva paralelné tenké rezy obličky potkana, ktoré boli analyzované jednak v móde SQ-O₂ (Obr. 6, Obr. 7) a TQ-O₂ (Obr. 8, Obr. 9). Ako reakčný plyn bol zvolený kyslík. Rovnako bola analyzovaná tiež pečeň krysy (Obr. 10).

Obr. 6: Mikroskopické obrázky tenkých rezov obličky krysy nasnímané metódou fluorescencie (vľavo) a metódou vo svetlom poli (vpravo) pre analýzy v SQ-O₂ móde

Obr. 7: Mapy priestorovej distribúcie ⁵⁷Fe (vľavo) a  ⁷⁷Se¹⁶O (vpravo) pre SQ-O₂ mód

Obr. 8: Mikroskopické obrázky tenkých rezov obličky krysy nasnímané metódou fluorescencie (vľavo) a metódou vo svetlom poli (vpravo) pre analýzy v TQ-O₂ móde

Obr. 9: Mapy priestorovej distribúcie ⁵⁷Fe (vľavo) a  ⁷⁷Se¹⁶O (vpravo) pre TQ-O₂ mód

Na Obr. 7 je zrejmá schopnosť mapovať distribúciu Fe a Se v móde SQ-O₂ . Pre ⁵⁷Fe (Obr. 7 vľavo) je však intenzita pozadia príliš vysoká vďaka prítomným interferentom ⁴⁰Ar¹⁶O¹H a  ⁴⁰Ar¹⁷O v kolíznej cele, čo sťažuje odlíšenie vzorky od pozadia. U  ⁷⁷Se¹⁶O (Obr. 5 vpravo) je síce pozadie blízke nule, avšak intenzity izotopu Se o m/z 77 sú príliš nízke pre vizualizáciu. Hlavný izotop m/z 80 (tu neukazovaný) dáva ešte horšie výsledky vďaka silnej interferencii Ar napriek posunu hmôt a tvorby ⁹⁶Ar₂O z iónov ⁴⁰Ar⁺ a  ⁴⁰Ar¹⁶O⁺.

Naproti tomu výsledky za použitia TQ-O₂ módu ukazujú jasné mapy distribúcie Fe aj Se (Obr. 7). Pri meraní ⁵⁷Fe (Obr. 7 vľavo) sa na prvom kvadrupóle (Q1) odstránili prekurzory iónov Ar⁺, ktorý tak ďalej nemohol reagovať s kyslíkom v reakčnej cele, a došlo tak k výraznému zníženiu intenzít pozadia a jasnému vykresleniu detailnej mapy distribúcie Fe. U  ⁸⁰Se¹⁶O (Obr. 7 vpravo) sú intenzity stále relatívne nízke vďaka malému množstvu Se prítomnému vo vzorke. Vďaka TQ-O₂ módu však boli odstránené prekurzory iónov na báze argónu a navyše bola znemožnená oxidácia diméru ⁸⁰Ar² a tak boli efektívne odstránené nežiaduce interferencie na tomto m/z. Hlavný izotop Se o m/z 80 po posune hmoty na m/z 96 umožňuje mapovanie distribúcie Se vo vzorkách aj s veľmi nízkym obsahom tohto prvku.

Obr. 10: Mikroskopické obrázky tenkých rezov pečene krysy nasnímané metódou fluorescencie (vľavo) a metódou vo svetlom poli (vpravo) pre analýzy v móde KED (vľavo) a v TQ-O₂ móde

Obr. 11: Mapy priestorovej distribúcie ²³Na (vľavo) a  ⁵⁷Fe (vpravo) pre SQ-KED mód

Obr. 12: Mapy priestorovej distribúcie ²³Na (vľavo) a  ⁵⁶Fe¹⁶O (vpravo) pre TQ-O₂ mód

Mapy distribúcie prvkov sú viditeľné u oboch módov, SQ-KED (Obr. 9 vľavo) i TQ-O₂ mód (Obr. 10 vľavo). Sodík nie je príliš zaťažený interferenciami, čo sa prejavuje najmä tým, že pridanie ďalšieho kvadrupólu v móde TQ-O₂ nespôsobilo výrazné zoslabenie citlivosti, ako by sa očakávalo (maximum 4,5.10⁶ v SQ-KED móde vs. 4,0.10⁶ v móde TQ-O₂ ).

Tiež distribúcia Fe pozorovaná pomocou SQ-KED (Obr. 10 vľavo) módu a TQ-O₂ módu je podobná (Obr. 10 vpravo). Avšak SQ-KED mód umožňuje elimináciu interferencií iba u izotopu ⁵⁷Fe, zaťial čo v móde TQ-O₂ možno merať hlavný izotop o m/z 56 (posunutý na m/z 72). To vedie k výrazne vyššej citlivosti v TQ-O₂ (7,0.10³ v SQ-KED móde vs. 7,0.10⁴ v móde TQ-O₂ ).

Záver

Technológia s trojitým kvadrupólom iCAP TQ ICP-MS jednoducho a s vynikajúcou reprodukovateľnosťou eliminuje spektrálne interferencie na kľúčových analytoch (P, S, Ca, Se, Fe) pri mapovaní distribúcie prvkov v biologických materiáloch.

Zdroj:

Aplikačná poznámka Thermo Scientific – AN-43358, na stiahnutie tu .

Autori:

Georgina M. Thyssen¹, Michael Sperling^1,2, Uwe Karst¹, Christoph A. Wehe³, Julian D. Wills³

¹ Institute of Inorganic and Analytical Chemistry, University of Münster, Corrensstr. 28/30, 48149 Münster, Germany

² European Virtual Institute for Speciation Analysis, Mendelstr. 11, 48149 Münster, German

³ Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Straße 11, 28199 Bremen, Germany