V minulom diele sme písali o spôsobe detekcie a aké detektory sú možné pre nový STELLARIS systém. V tomto diele sa budeme venovať akusticko-optickému prvku AOBS a laserom, ktoré je možné pripojiť do systému.

Viac signálu = kvalitné výsledky

Prepracovaný programovateľný kryštál s názvom AOBS2 (Acousto Optical Beamsplitter) je výraznou inováciou v celej konfokálnej hlave. Tento kryštál riadený akustickým signálom je možné použiť pre nadviazanie špeciálneho pulzného laserového bieleho zdroja svetla. Vďaka vlastnostiam kryštálu s priloženým akustickým signálom možno vo vnútri vytvoriť také vlastnosti, aby bolo možné cez jeden tento prvok nadviazať niekoľko laserových vlnových dĺžok súčasne. Číselne vyjadrené je možné nadviazať až 8 vlnových dĺžok. Optický kryštál je vysoko transparentný, s výnimočnými vlastnosťami aj v emisnej časti, a to je pre získavanie emitovaného signálu kritická časť. Na obr. 1 je uvedené porovnanie klasických dichroických zrkadiel s AOBS.

Obr. 1 – Porovnanie dichroických zrkadiel a AOBS

Dichroické zrkadlá majú veľkú medzeru v emisnom spektre, vďaka nedokonalej výrobe filtrov všeobecne. Vďaka väčšej medzere je potom získavaný signál odfiltrovaný a tým celkovo znížený. U AOBS prvku sú tieto medzery v emisnom spektre naozaj malé a signálu je potom viac. Celkovo potom možno použiť nižšie intenzity u použitých laserov a tým znížiť osvetľovanie preparátov (photodamage, bleaching - nežiaduci jav).

Z aplikačného pohľadu je potom výhodou použitia AOBS možnosť vyhnúť sa sekvenčnému snímaniu niekoľkých kanálov, vrátane použitia super-rozlišovacieho modulu a pod., eliminácia cross-talk čiže prekryvu fluorescenčného signálu z jedného fluorofóru do druhého a v neposlednom rade vyššiu priepustnosť tohto prvku ako cez dichroické zrkadlá. Nový AOBS2 dokáže plne odfiltrovať aj signál, ktorý prichádza priamo do detektora. Cross-talk možno v systéme STELLARIS riešiť naozaj mnohými spôsobmi. STELLARIS vie hardvérovo nastaviť a oddeliť spektrá pomocou detektorov a ich konštrukciou. Veľkou novinkou sú potom TauSENCE kontrasty, o ktorých budeme písať v ďalšom diele, ktorý si nenechajte ujsť. Na obr. 2 sú zobrazené živé Hela bunky značené štyrmi rôznymi fluorofórmi na identifikáciu jadier, aktínu, tubulínu a plazmatickej membrány. Nastavením systému STELLARIS je možné všetky 4 kanály nasnímať naraz s nastavením každého detektora špecificky pre získanie najlepšieho dynamického pomeru.

Obr. 2 – Ukážka jednoduchého snímania bez použitia sekvenčného snímania pre HeLa bunky a štyri fluorescenčné značky naraz

Biely laser a ďalšie laserové zdroje

Vzhľadom na dnešné zložité výskumné otázky vedci potrebujú systémy, ktoré sú veľmi intuitívne, spoľahlivé, orientované pre široké spektrum použitia. Systémy by mali ponúkať predovšetkým jednoduché použitie bez nutnosti poznať dokonale všetky vlastnosti zapojenia systému a pod. Výsledkom by mala byť dôležitá biologická či iná informácia, ktorá posunie výskum zase o krôčik ďalej. Ďalší vývoj smeruje k viacfarebným experimentom, rýchlejšiemu snímaniu a vyššej flexibilite systému.

Späť k laserovým zdrojom, tých môže byť celý rad. Ako sú do tradičných systémov implementované, hrá veľkú úlohu a veľmi sa rieši celková priepustnosť a použitie jednotlivých systémov. Diskrétne lasery obmedzujú Vašu flexibilitu pri výbere jednotlivých fluorofórov predovšetkým z pohľadu nepresného nastavenia lasera do excitačného maxima daného fluorofóru. To znamená vyššiu nastavenú intenzitu laserov pre exctitáciu fluorofórov a tým vyššiu toxicitu vzoriek. Technológia novej generácie lasera s bielym svetlom ( WLL2 ), v spojení s rodinou detektorov Power HyD umožní optimálne zobrazovať prakticky akýkoľvek fluorofór v dostupnom spektrálnom rozsahu. Aký je ten rozsah? Obrovský. Pre systém STELLARIS 5 je možné použiť pulzný biely laser s rozsahom vlnových dĺžok od 485 až 685 nm , s možnosťou voľby jednotlivej vlnovej dĺžky po 1 nm. Pri systéme STELLARIS 8 je potom biely laser s rozsahom vlnových dĺžok od 440 až 790 nm opäť s možnosťou voľby po 1 nm. Pripočítajte si tiež možnosť použitia klasických laserových zdrojov do systému. Tým sa Vám ponúkajú obrovské možnosti použitia pre všetky konfokálne aplikácie. Zrátané a podčiarknuté STELLARIS 5 200 vl. dĺžok a STELLARIS 8 až 350 vl. dĺžok pre excitáciu + klasické laserové zdroje uvedené na obr. 3. Zaujíma Vás životnosť bieleho lasera? Biely laser je vyvíjaný v spolupráci s firmou NKT, niektoré dlhodobé testy uvádzajú viac ako desiatky tisíc hodín. Výkon bieleho lasera postačí na 99% aplikácií, výkon je definovaný na jednotlivé laserové čiary a tým sa opäť otvárajú ďalšie možnosti v použití pre FRAP experimenty a pod.

Obr. 3 – Možnosť použitia laserových zdrojov pre systémy STELLARIS

Oblasť NIR s bielym laserom až do 850 nm

Väčšina konvenčných konfokálnych systémov je vybavená len jednou alebo dvomi samostatnými laserovými linkami v červenej NIR oblasti. Okrem toho konvenčné GaAsP detektory nie sú dostatočne citlivé v rozsahu pre NIR oblasť. Oba tieto faktory výrazne obmedzujú počet červených farbív, ktoré možno zobraziť v jedinom experimente. Trend poslednej doby ukazuje posun do NIR oblasti, kde sú farbivá stabilnejšie a menej náchylné na fototoxicitu. Ukážka na obr. 4 s bunkami Cos-7 značené červeno excitovateľnými sondami špecifickými pre aktín, mitochondriálnu vonkajšiu membránu a tubulín. Tradičná konfokálna mikroskopia s detektorom GaAsP deteguje iba SiRActin. Pri použití rozšíreného WLL2 na STELLARIS 8 spoločne s  detektorom HyD R je teda možné snímať aj v oblasti NIR až do 850 nm!

Obr. 4 – Aplikačná ukážka pre fluorescenčné značenie do NIR oblasti

Kde sa lasery pripájajú?

Pripojenie laserov v skenovacej hlave je uvedené na obr. 5, ktorý ste už mohli vidieť v predchádzajúcom diele seriálu o STELLARIS. Dôležitá časť pre tento diel je pripojenie laserových zdrojov v pravej časti obrázku. Riadenie laserov je väčšinou riadené cez AOTF (Akusticko-opticky laditeľný filter), ktorý ovláda nastavenie intenzity pre použitý laser či DMOD (direct modulácia). Pre systémy s MP laserom je to potom AOM (akusticko-optický modulátor). Aký laser použiť, závisí od aplikácie. Ak neviete, aký typ lasera by ste mali použiť, prosím, napíšte nám, radi Vám pomôžeme.

Obr. 5 – Skenovacia jednotka systému STELLARIS 8

Čo bude v ďalšom diele?

V ďalšom diele sa zameriame na technológiu detektorov Power HyD S, R, X a novinku pre systémy STELLARIS TauSENSE . Ukážeme si tiež, ako flexibilný a jednouchý môže systém STELLARIS byť.

Na niečo sme zabudli? Niečo nie je správne opísané? Máte akúkoľvek otázku? Napíšte nám na: mikroskopie@pragolab.cz