V minulom diele sme písali o AOBS a použití rôznych laserov v systéme STELLARIS. V predchádzajúcich dieloch sme predstavili nové detektory , ale nezaoberali sme sa princípom a prierezom rôznych technológií pre detektory. V tomto diele sa budeme týmto technológiám venovať a predstavíme novinku Leica STELLARIS TauSENSE v podobe TauGating, TauContrast a TauSeparation.

Nie je detektor ako detektor

Začneme u najjednoduchšieho a najznámejšieho typu detektora používaného u bežných konvenčných konfokálnych systémoch: PMT (Photomultiplier Tubes) - viď obr. 1. Je známy už od začiatku 30. rokov [1]. Je založený na fotoelektrickom jave, ktorý prvýkrát opísal H. Hertz [2] a interpretoval A. Einstein [3]. Fotokatóda je obvykle vrstva alkalických atómov, ktorá uvoľní elektróny po absorpcii fotónov na túto vrstvu. Fotokatóda je zvyčajne vystavená žiareniu fotónov, ktoré sa deteguje ako signál. Účinnosť týchto fotokatód je okolo 30% QE (kvantová účinnosť = koľko fotónov dopadne v pomere ku generovaným elektrónom). Priložené napätie umožňuje zrýchliť fotoelektrón na prvú dynódu, kde sa uvoľňujú sekundárne elektróny. Zisk na dynódach je zvyčajne obmedzený na menej ako päťnásobok, kvôli vlastnostiam materiálu dynód. Elektrický impulz generovaný jedinou dynódou nemožno odlíšiť od elektrického šumu. Aby sa dosiahol dostatočný zisk, sú sekundárne elektróny urýchľované na ďalšiu dynódu atď. [4]. Slabé signály s vyšším gain (vyššie napätie pre urýchlenie) sú s veľkým šumom na pozadí.

Obr. 1 - Trubica fotonásobiča (PMT): Foton (hν) zasiahne fotokatódu, kde sa uvoľní fotoelektrón (e-). Počet elektrónov (modré bodky) sa vynásobí na každej dynóde a konečný elektrónový mrak sa odčíta na anóde.

GaAsP (PMT) detektor už nie je ten najlepší

Vďaka vývoju materiálov možno pomer QE zlepšiť použitím katódy pre PMT detektor s vrstvou gálium arzenidu (GaAsP) až na QE okolo 45%, čo prinesie zlepšenie pri slabších signáloch. Čo ale so spomínaným šumom pre taký typ detektora? Správne si odpovedáte áno, nič sa nemení, čím viac zvyšujete gain, tým viac šumu generujete. Často si kladieme, akú hodnotu gain nastaviť, ako kvantifikovať pod. Ako toto vyriešiť?

Lavínová fotodióda APD (Avalanche Photodiodes) prináša veľké zlepšenie z pohľadu šumu. Upravená PIN dióda, doplnená multiplikačnou vrstvou – viď obr. 2. Ak je fotón absorbovaný vo vnútornej vrstve, vygeneruje nábojový pár (vnútorný fotoelektrický efekt), náboj je potom zrýchlený aplikovaným napätím. Silné elektrické pole v multiplikačnej zóne (pn, na obr. 2) spôsobuje zosilnenie uvoľnením mnohých (až približne 1000) ďalších nábojov. Výstupný signál je úmerný počtu absorbovaných fotónov, preto možno zariadenie v určitom rozsahu intenzity použiť ako svetelný senzor.

Obr. 2 - Lavínová fotodióda (APD): absorpcia fotónu vo vnútornej (i) zóne spôsobí oddelenie náboja, náboj je ďalej distribuovaný do multiplikačnej zóny (pn), kde sa dosahuje vyšších ziskov

GaAsP vrstva a APD = Leica Power HyD

Hlavným obmedzením PMT je nízky zisk v každom kroku násobenia a generovanie šumu. Hlavným obmedzením APD je rozsah činnosti: iba veľmi nízkej intenzity. Hybridná kombinácia oboch technológií ponúka riešenie, ktoré našťastie ukazuje výhody oboch. Táto kombinácia vákuovej a polovodičovej technológie bola pôvodne vyvinutá pre experimenty vo fyzike častíc [5]. Leica Microsystems vyvinula tento nový typ detektora pre konfokálne systémy. Princíp je zobrazený na obr. 3, kedy sa generuje signál na vysoko citlivej vrstve GaAsP či SiliconBased a vyrážajú sa elektróny, ktoré sú urýchlené na časti APD detektora. Obrovská výhoda je minimalizácia výsledného šumu a rýchlosť detekcie jednotlivých prichádzajúcich fotónov. Neunikne Vám už ani jeden fotón!

Obr. 3. - Princíp HyD detektora a porovnanie rýchlosti detekcie jednotlivých signálov

Nový rad Power HyD S, X, R detektorov

Ďalším veľmi dôležitým parametrom je zisk signálu pre jednotlivé detektory v celej spektrálnej oblasti, resp. kde aký detektor je vhodné použiť. U novej série detektorov Leica Power HyD S je tento rozsah naozaj obrovský. Celé spektrum pre použitie je zobrazené na obr. 4. Ďalší HyD X a HyD R je dedikovaný pre FLIM, FCS, FLIM-FRET experimenty so systémom STELLARIS8 FALCON. Posledný z radu Power HyD R je s vyšším ziskom v červenej oblasti. Všetky detektory sú prispôsobené pre snímanie až do 850 nm! Aký vybrať? HyD S je naozaj dobrá voľba pre rutinné snímanie, HyD X a HyD R sú odporúčané pre FLIM, FCS experimenty a HyD R navyše až do 850 nm.

Obr. 4. - Spektrálny rozsah jednotlivých detektorov

Ďalšou vlastnosťou tohto detektora je možnosť prepnutia z analógového módu do digitálneho pre veľmi silné signály, použitie pre reflexiu a pod., viď obr. 5.

Obr. 5.  Ukážka rôznych módov pre Power HyD S detektor

Nová technológia STELLARIS TauSense

Do súčasnosti väčšina systémov merala iba intenzitu fluorescencie. Nová technológia s názvom STELLARIS TauSENSE Vám dáva potenciál pridať novú informáciu, nielen o intenzite, ale predovšetkým o čase príchodu fotónu (lifetime). Informáciu o lifetime spracováva do metadát ku každej snímke. Vhodné to je predovšetkým preto, keď si nie ste istí cross-talkom, autofluorescenciou, artefaktom, a pod. V skratke táto technológia odkryje všetky nepresnosti, ktoré môžu pri snímaní nastať. STELLARIS TauSENSE obsahuje niekoľko možností separácie, ako napríklad TauContrast, TauGating, TauScan a TauSeparation, ktoré si rozoberieme.

Začneme s prvou spomínanou technológiou TauContrast . Kontrast je detegovaný pre každý pixel priemerným časom príchodu (AAT) fotónov detegovaných počas doby oneskorenia pixelu (pixel dwell time). Snímky ukazujú cicavčiu bunku značenú takmer infračervenou membránovou farbou. Šípky označujú vezikuly s rôznymi hodnotami pH (červená, modrá, zelená). Na obr. 6 je obrázok intenzity: bodové vezikuly vykazujú vyššiu intenzitu než okolitá cytoplazma. Obrázok TauContrast: s tabuľkou (LUT) farebné prekrytie zodpovedá AAT (0-1 ns); zmeny vezikulárneho pH počas internalizácie sú evidentnejšie ako na obrázku intenzity, s meradlom 20 μm.

Obr. 6.  STELLARIS TauSENSE a jednotlivé módy TauContrast

Vďaka tejto metóde získate prístup k fyziologickým informáciám s parametrami, ako sú zmeny pH, teploty a koncentrácie iónov. Okrem zohľadnenia informácií o intenzite fluorescencie pre každý pixel obsahuje podrobnosti o priemerných časoch príchodu fotónu (lifetime), ktoré sa môžu meniť v závislosti od posunov v mikroprostredí. Pomocou TauContrast možno takéto zmeny mapovať a vizualizovať. Napríklad rozdiely v hodnotách pH intracelulárnej vezikuly nie sú podľa intenzity fluorescencie zbadateľné. S TauContrast sú tieto rozdiely odhalené, pretože lifetime jednotlivých fluorofórov sa líši v závislosti od lokálnej hodnoty pH.

Ďalšou možnosťou je aj technológia TauGating , ktorý možno použiť na odstránenie nežiaduceho signálu opäť na základe lifetime jednotlivých fotónov. Napríklad snímky intenzity bazálnej membrány v živých bunkách často obsahujú reflexiu, ktorá môže maskovať dôležitý signál. Odrazené fotóny majú kratšie lifetime v porovnaní s fluorescenčným signálom a preto možno rozlíšiť a odseparovať signály pomocou funkcie TauGating. Na obr. 7 je uvedený príklad pre TauGating, ktoré oddeľujú nežiaduci signál od endogénneho pigmentu (purpurová, krátke ATs) spočítaním fotónov prichádzajúcich počas vybraného časového úseku. Získame tak čistý sledovaný signál (azúrová, dlhá ATs) Stupnica: 200 μm. (Ukážka obrázku so zvolením: Julien Vermot, IGBMC, Štrasburg). Vzorka zebrafish z radu 4xGTIIC: d2GFP, ktorá stále obsahuje ich natívne pigmenty. Signál GFP poskytuje odčítanie aktivity Yap1/Taz-Tead a tu sa používa na vizualizáciu pruhovaného svalu trupu.

Obr. 7 - STELLARIS TauGating

Poslednou novou technológiou sú TauScan a TauSeparation , využívajú lifetime pre oddelenie fluorofórov, ktoré nemožno spektrálne oddeliť pomocou spomínaných dvoch predchádzajúcich technológií. Využitím rozdielov v časoch príchodu jednotlivých fotónov a signálov od LifeAct-GFP a MitoTracker Green (purpurová) možno jasne oddeliť jednotlivé fluorofóry, hoci sa výrazne spektrálne prekrývajú. Táto technológia významne rozširuje potenciálny počet a kombinácie fluorofórov, ktoré možno použiť v jednom experimente. Na obr. 8 je uvedený TauScan a TauSeparation buniek cicavcov exprimujúcich LifeAct-GFP (vyrábaný spoločnosťou ibidi GmbH) a označené zelenou mitochondriálnou škvrnou. Schéma ukazuje distribúciu komponentov po celý čas životnosti s meradlom 10 μm. Tiež je vidieť časové vyhodnotenie doby života (lifetime) v kombinácii s počtom fotónov.

Obr. 8 - STELLARIS TauScan a TauSeparation

STELLARIS Vám otvára nové možnosti

STELLARIS prináša nový rozmer pre konfokálnu mikroskopiu a poskytuje výrazne viac informácií ako súčasné konvenčné konfokálne systémy. S kontrastmi TauSENSE a len niekoľkými kliknutiami môžete odstrániť nechcený signál a odhaliť viac detailov na svojich snímkach, multiplexovať viac fluorescenčných farbív v jednom experimente a oddeliť fluorofóry, ktoré majú prekrývajúce sa spektrá. Sila v použití lifetime je obrovská a Vy preskúmate mnoho lokalizačných aj mikroenvironmentálnych zmien. Kľúčové potom je, že STELLARIS zhromaždí všetky tieto informácie aj z jediného detektora a zostávajúce detektory nechá voľné pre ďalšie fluorescenčné farbivá. Porovnanie technológií je potom na obr. 9, kde je znázornené, ako jednoducho možno nadefinovať na dva detektory až štyri fluorescenčné lifetime kanály.

Obr. 9  - STELLARIS vs. tradičné konfokálne mikroskopy bez lifetime

Čo bude v ďalšom diele?

V ďalšom diele sa zameriame na rýchlosť konfokálnych systémov, jednoduchosť použitia konfokálnych systémov s Image Compas a LAS X Navigator.

Na niečo sme zabudli? Niečo nie je správne opísané? Máte akúkoľvek otázku? Napíšte nám na: mikroskopie@pragolab.cz

Všetky staršie články tu:

Seriál o STELLARIS systémoch - 1. diel: Detekcia  
Seriál o STELLARIS systémoch - 2. diel: AOBS a Lasery

Referencie: